1.光譜法

吸收光譜法

CY5 在 640 - 660nm 左右有特征吸收峰。標記牛血清白蛋白（BSA）后，可以通過紫外 - 可見分光光度計測量 CY5 - BSA 在該波長范圍內的吸收情況。

根據朗伯 - 比爾定律（A = εbc，其中 A 是吸光度，ε 是摩爾吸光系數，b 是光程長度，c 是物質的濃度），比較 CY5 - BSA 和已知濃度 CY5 標準溶液的吸光度。如果已知 CY5 的摩爾吸光系數和光程長度，就可以大致計算出 CY5 - BSA 中 CY5 的含量，從而評估標記效率。例如，假設 CY5 標準溶液在 650nm 處的吸光度為 A1，濃度為 c1，CY5 - BSA 在相同波長下吸光度為 A2，在相同光程下，CY5 - BSA 中 CY5 的濃度 c2 =（A2/A1）×c1。標記效率可以用（c2 / 理論標記 CY5 濃度）×100% 來表示。

熒光光譜法

CY5 的熒光發射峰在 650 - 700nm 之間。使用熒光光譜儀測量 CY5 - BSA 的熒光強度。

同樣通過與已知濃度 CY5 標準品的熒光強度對比來計算標記效率。在相同的激發波長和測量條件下，假設已知濃度 CY5 標準品的熒光強度為 F1，濃度為 c1，CY5 - BSA 的熒光強度為 F2，CY5 - BSA 中 CY5 的濃度 c2 =（F2/F1）×c1。標記效率計算公式同吸收光譜法中的計算方式。不過需要注意的是，熒光強度可能會受到環境因素（如 pH、離子強度等）和儀器因素（如激發光強度、探測器靈敏度等）的影響，所以測量時要保證測量條件的一致性。

2.電泳法

聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE）結合熒光成像

將 CY5 - BSA 和未標記的 BSA 進行 SDS - PAGE 電泳。由于 CY5 的標記，CY5 - BSA 分子量增加，在凝膠中的遷移率會比未標記的 BSA 慢。

通過熒光成像系統觀察電泳后的凝膠，分析 CY5 - BSA 和未標記 BSA 條帶的強度。如果可以確定未標記 BSA 的量（例如通過蛋白定量方法如考馬斯亮藍法測定蛋白濃度后上樣相同量的蛋白），并且 CY5 - BSA 條帶的熒光強度能夠準確量化（使用合適的圖像分析軟件），就可以計算標記效率。標記效率 =（CY5 - BSA 條帶熒光強度對應的蛋白量 /（CY5 - BSA 條帶熒光強度對應的蛋白量 + 未標記 BSA 條帶蛋白量））×100%。這種方法相對直觀，但對成像設備和圖像分析的準確性要求較高。

3.色譜法

高效液相色譜（HPLC）或尺寸排阻色譜（SEC）

通過 HPLC 或 SEC 分離 CY5 - BSA 和未標記的 BSA 以及未反應的 CY5。在合適的色譜條件下，它們會在不同時間出峰。

對于 SEC，根據分子大小進行分離，CY5 - BSA 由于分子較大，出峰時間會早于未反應的 CY5。通過積分峰面積，可以計算出 CY5 - BSA 的含量。假設總峰面積（CY5 - BSA 峰面積 + 未反應 CY5 峰面積）為 A 總，CY5 - BSA 峰面積為 A 標，標記效率 =（A 標 / A 總）×100%。HPLC 可以根據不同的分離機制（如反相色譜等）進行更精細的分離，計算標記效率的原理類似，但需要對色譜峰進行準確的鑒定和積分。

4.放射性同位素標記結合法（如果 CY5 或 BSA 可以進行放射性同位素標記）

例如，先將 CY5 或 BSA 中的一種用放射性同位素（如 3H、1?C 等）標記，然后進行標記反應。

反應完成后，通過放射性測量儀分別測量 CY5 - BSA 產物和未反應的標記原料的放射性強度。假設 CY5 - BSA 產物的放射性強度為 I1，未反應的標記原料放射性強度為 I2，標記效率 =（I1/（I1 + I2））×100%。這種方法比較準確，但涉及放射性物質，操作需要嚴格遵守相關安全規定。

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