乳糖 - N - 三糖（LNT）的制備方法主要圍繞 “化學合成"“酶催化合成" 和 “天然提取" 三大技術路徑展開，不同方法在效率、純度和應用場景上存在差異，具體如下：
通過化學試劑調控糖苷鍵的形成，實現單糖單元（半乳糖、葡萄糖、N - 乙酰氨基葡萄糖）的定向連接，核心是解決糖苷鍵的 regioselectivity（區域選擇性）和 stereoselectivity（立體選擇性）問題。
關鍵步驟：
對單糖原料的羥基進行保護（如使用乙酰基、芐基），避免非目標位點反應；
活化供體糖（如將半乳糖制成三氯乙酰亞胺酯供體），與受體糖（如乳糖或葡萄糖）在催化劑（如三氟甲磺酸三甲基硅酯）作用下形成目標糖苷鍵；
脫除保護基團，純化得到乳糖 - N - 三糖。
利用酶（主要是糖苷轉移酶）的專一性，高效催化糖苷鍵形成，是目前工業級制備 LNT 的主流方向，分為 “單酶催化" 和 “多酶級聯催化" 兩種策略。
使用特定糖苷轉移酶，直接將 N - 乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）轉移到乳糖（Galβ1-4Glc）的特定羥基上，形成 LNT 的核心結構（Galβ1-4Glcβ1-3GlcNAc）。
常用酶類：β-1,3-N - 乙酰氨基葡萄糖轉移酶（如來自大腸桿菌的 LgtA 酶），需搭配糖核苷酸供體（如 UDP-GlcNAc，尿苷二磷酸 - N - 乙酰氨基葡萄糖）提供糖基。
特點：反應特異性高，副產物少，反應條件溫和（常溫、近中性 pH），易控制。
通過構建 “供體合成 - 糖基轉移 - 產物釋放" 的酶促反應體系，解決單酶催化中 “糖核苷酸供體成本高" 的問題，實現原料（如葡萄糖、GlcNAc、ATP/UDP 等）到 LNT 的一步轉化。
從天然富含 LNT 的原料中分離純化，主要來源是人乳（人乳寡糖中 LNT 含量約 0.5-1.5 g/L）或部分哺乳動物乳汁（如牛初乳，含量遠低于人乳）。
關鍵步驟：
原料預處理：去除乳汁中的蛋白質（如離心、酸沉）、脂肪（如脫脂）；
寡糖分離：通過超濾（去除大分子）、離子交換層析（去除帶電雜質）、凝膠過濾層析（按分子量分離）等步驟富集 LNT；
純化結晶：通過高效液相色譜（HPLC）精制，得到高純度 LNT。
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